CRISPR/CAS是什么？

CRISPR/CAS是什么鉴嗤？

CRISPR代表"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）斩启。II型原核生物CRISPR“免疫系統(tǒng)”的發(fā)現(xiàn)序调，使得能夠開發(fā)簡單醉锅、易用、快速實施的RNA指導(dǎo)的基因組編輯工具发绢。CRISPR首字母縮寫通常發(fā)音為“ crisper”硬耍。

CRISPR / CAS采用何種工作原理？

CRISPR通路在細菌中被發(fā)現(xiàn)边酒，其功能很像免疫系統(tǒng)经柴，可以抵御入侵的病毒和質(zhì)粒DNA。來自入侵病毒的短DNA序列（間隔區(qū)）摻入細菌基因組內(nèi)的CRISPR基因位點墩朦，并充當(dāng)先前感染的“記憶”坯认。再感染引發(fā)互補的成熟CRISPR RNA（crRNA）以找到匹配序列 — 其為CRISPR相關(guān)（Cas）核酸酶提供特異性，以在特定 “外源” DNA序列處形成雙鏈斷裂。

圖 1.基因組靶標(biāo)位點
CRISPR CAS9采用何種工作原理牛哺？
為了創(chuàng)建這樣的工具陋气，內(nèi)源CRISPR途徑被簡化為兩個主要組分：Cas9核酸酶和指導(dǎo)RNA（gRNA）1-7。導(dǎo)向RNA是由crRNA和tracrRNA組成的雙組分系統(tǒng)引润。crRNA靶向待切割的雙鏈DNA巩趁，并且具有短的同源區(qū)域，允許其結(jié)合tracrRNA淳附。 tracrRNA提供與Cas9蛋白結(jié)合的莖環(huán)結(jié)構(gòu)议慰。crRNA:tracrRNA雙鏈體被稱為gRNA。 Cas9核酸酶和gRNA形成Cas9核糖核蛋白（RNP）奴曙，可以在整個基因組環(huán)境中結(jié)合并切割特定的DNA靶標(biāo)别凹。為了被RNP切割，靶必須具有兩個特定序列洽糟。首先番川，gRNA需要17-21個堿基的RNA至DNA同源性，這被稱為前間隔序列脊框。 其次颁督，Cas9蛋白需要有一個短的前間隔序列鄰近基序（PAM），以結(jié)合靶DNA（參見圖2）浇雹。 如果存在連接tracrRNA沉御，并且在gRNA和基因組靶標(biāo)之間存在足夠的同源性，則RNP切割靶DNA的兩條鏈昭灵，在基因組中的該位置處產(chǎn)生DSB吠裆。

圖 2.CRISPR / Cas靶向雙鏈斷裂的示意圖。

雖然細胞核中的功能性CRISPR是RNP形式烂完，但作為分子工具的CRISPR的組件適合于各種遞送方法试疙。 早期實驗成功地創(chuàng)建了嵌合單指導(dǎo)RNA或sgRNA，其將crRNA和tracrRNA組合成單個RNA鏈而不是天然存在的雙鏈體抠蚣。 該sgRNA和Cas9 mRNA可以從單個質(zhì)粒表達祝旷，用于直接轉(zhuǎn)染或包裝成用于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的顆粒。 也可將重組Cas9蛋白與合成產(chǎn)生的crRNA和tracrRNA組合嘶窄，以生成RNP轉(zhuǎn)染或顯微注射給胚胎怀跛。

靶向DSB形成后，細胞通常使用兩種DNA修復(fù)途徑中的一種來存活：非同源末端連接（NHEJ）或同源依賴性修復(fù)（HDR）柄冲。這些修復(fù)機制經(jīng)常會出錯吻谋，導(dǎo)致在靶位置誘變，或者通過破壞編碼序列來功能性地失活或敲除基因（NHEJ）现横，或者通過添加新的DNA序列來敲入特定的序列變化（HDR）漓拾。通過這種方式阁最，CRISPR / Cas9系統(tǒng)能夠?qū)θ旧wDNA進行的、可遺傳的修飾骇两。此外闽撤，當(dāng)Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域失活并附著于其他效應(yīng)分子以作用于基因組中的gRNA指定位點時，CRISPR系統(tǒng)可用作靶向遞送系統(tǒng)脯颜。 這將CRISPR系統(tǒng)功能擴展到基因激活和抑制哟旗。zui后，CRISPR系統(tǒng)可用于篩選栋操。CRISPR / Cas9系統(tǒng)的基因敲除闸餐、基因敲入、基因激活或抑制矾芙、以及篩選這四種主要用途將在下面進一步討論舍沙。

基因敲除

當(dāng)與靶向基因特異的gRNA一起共表達時，CRISPR / Cas9產(chǎn)生敲除細胞或動物模型剔宪》髡。基因敲除的目的是通過破壞其在細胞中的表達來揭示基因功能。共表達的適當(dāng)設(shè)計的gRNA指導(dǎo)Cas9切割靶序列葱绒，并在目的基因中產(chǎn)生DSB感帅。然后可以通過三種方式中的任何一種實現(xiàn)基因敲除：1）細胞通過NHEJ修復(fù)斷裂，導(dǎo)致切割基因的開放閱讀框（ORF）內(nèi)的隨機插入或缺失（“插入缺失”）地淀；2）細胞通過HDR從用戶提供的模板修復(fù)斷裂失球，將特定的破壞性序列插入ORF中；3）一對gRNA產(chǎn)生兩個DSB帮毁，其位于基本編碼序列的側(cè)翼实苞，導(dǎo)致其切除。

NHEJ是zui活躍的修復(fù)機制烈疚，但是容易出錯黔牵，并且經(jīng)常引入移碼，導(dǎo)致過早終止密碼子和/或?qū)е滤棉D(zhuǎn)錄物成為無義介導(dǎo)的衰變（NMD）的靶標(biāo)爷肝。移碼修飾可導(dǎo)致過早終止密碼子被引入轉(zhuǎn)錄物猾浦，阻止氨基酸鏈的關(guān)鍵部分被翻譯，導(dǎo)致異常短的無功能蛋白質(zhì)阶剑。無義介導(dǎo)的衰變通過消除含有過早終止密碼子的mRNA轉(zhuǎn)錄物來減少基因表達中的錯誤跃巡。 理論上危号，當(dāng)外顯子-外顯子連接復(fù)合物（也就是RNA剪接期間在外顯子之間的前mRNA鏈上形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物）在轉(zhuǎn)錄物被剪接后未被核糖體適當(dāng)?shù)厝コ龝r牧愁，這個監(jiān)視途徑被激活。當(dāng)外顯子-外顯子連接復(fù)合物由于上游移碼而保持結(jié)合時外莲，轉(zhuǎn)錄物被指示降解猪半，并且功能蛋白質(zhì)從未被翻譯兔朦。這兩種途徑都有效破壞細胞中的基因功能。

基因敲入

CRISPR / Cas9也可用于引入或“敲入”新的DNA序列磨确。常見的修飾包括引入單核苷酸多態(tài)性（SNP）沽甥、小標(biāo)簽、loxP或更大的基因盒乏奥，例如熒光蛋白摆舟。這些修飾是通過特定位置的Cas9誘導(dǎo)的DSB進行的，這顯著增強了靶向整合的機會邓了。靶向整合（基因敲入）通過HDR發(fā)生恨诱。為了通過HDR進行基因編輯，必須將含有所需序列的DNA “供體” 或修復(fù)模板與gRNA和Cas9一起遞送至細胞骗炉，通常在供體質(zhì)琳毡Γ或寡核苷酸上【淇基因敲入的效率通常低于敲除（<10％的修飾等位基因）厕鹃，但可用于產(chǎn)生范圍從單核苷酸變化至大插入物的特定修飾。

基因激活和抑制

除了作為基因組編輯工具之外乍丈，CRISPR還可以用作其他功能蛋白的靶向遞送系統(tǒng)剂碴。Cas9的一個獨特特征是它能夠獨立于DNA切割而結(jié)合靶DNA，因為這是Cas9機制的兩個獨立步驟轻专。野生型Cas9具有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域：RuvC和HNH汗茄。為了在沒有切割的情況下實現(xiàn)結(jié)合，通過誘導(dǎo)點突變（SpCas9中的D10A和H840A）使兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域失活铭若，導(dǎo)致核酸酶死亡的Cas9（dCas9）洪碳。當(dāng)與靶向轉(zhuǎn)錄起始位點的gRNA組合時，發(fā)現(xiàn)單獨的dCas9足以通過阻斷轉(zhuǎn)錄起始來降低或抑制轉(zhuǎn)錄叼屠。在這一發(fā)展之后瞳腌，科學(xué)家開始嘗試將轉(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子與dCas9聯(lián)系起來。KRAB轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域已經(jīng)與dCas9融合镜雨，作為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默的模式嫂侍。dCas9也與轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)蛋白融合。用于激活的dCas9是廣泛流行的研究領(lǐng)域荚坞，并且包括諸如dCas9-VP64挑宠、dCas9_SunTag、dCas9-SAM颓影、dCas9-RNA支架和dCas9-VPR的系統(tǒng)各淀。 在我們的產(chǎn)品線中，我們將dCas9與人E1A相關(guān)蛋白P300的催化組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）核心結(jié)構(gòu)域融合诡挂。當(dāng)與靶向轉(zhuǎn)錄起始位點和增強子區(qū)域的gRNA組合時碎浇，dCas9-P300指導(dǎo)組蛋白乙趿倨祝化，從其異染色狀態(tài)釋放DNA奴璃，以通過天然染色體環(huán)境中的內(nèi)源細胞機制上調(diào)基因表達悉默。dCas9-P300組蛋白乙酰化方法代表了相對于dCas9-VP64或其他類似基因活化基序的獨特作用機制苟穆。

篩選

篩選可以快速調(diào)查大量候選基因或基因組位點抄课，以參與您的途徑或感興趣的表型。池化寡核苷酸生產(chǎn)和大數(shù)據(jù)處理的改進雳旅，加上慢病毒遞送的效率剖膳，使研究人員能夠同時考慮數(shù)千個候選基因，無論是作為文庫還是更為集中的子集（panel）岭辣。我們將文庫定義為CRISPR克隆的全部基因組集合吱晒；而子集（panel）則是較小的基因子集。通常沦童，子集（panel）和文庫可以以兩種形式組裝：池化（在一個管中有數(shù)千個gRNA）或排列（在96孔板中每個孔一個gRNA）仑濒。這兩種方法都能快速地為更大的問題提供答案，與過去的方法相比具有明顯的優(yōu)勢偷遗，過去的老方法需要一次一個地詢問候選基因墩瞳，是一個費時費力的過程。

我們提供多種篩選解決方案氏豌，包括來自Broad的池化GeCKO文庫喉酌，以及Sanger陣列全基因組慢病毒CRISPR文庫，以執(zhí)行大型基因敲除篩選（8）泵喘。并且泪电，人類和小鼠CRISPR / Cas9協(xié)同激活調(diào)控子（SAM）池化文庫亦即將推出，用于全基因組篩選轉(zhuǎn)錄激活表型纪铺！

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CRISPR / CAS9是什么蔬捷？

CRISPR / Cas9系統(tǒng)于1993年被發(fā)現(xiàn)，并且顯示在細菌和古細菌生物體內(nèi)進化伏社，作為對病毒和外來質(zhì)粒的防御抠刺。天然CRISPR途徑的功能是將核酸酶靶向侵入性DNA塔淤，產(chǎn)生潛在致命的雙鏈斷裂（DSB）摘昌。在識別該途徑的功能后不久速妖，來自細菌化膿性鏈球菌（SpCas9）的II型CRISPR / Cas9系統(tǒng)被重新利用以產(chǎn)生簡單但強大的分子工具，其可被編程以將核酸酶靶向特定的基因組序列聪黎。