核酸分子雜交的類型和分子雜交方法

作者：上海峰志儀器時間：2022-09-22 08:41:47瀏覽7173 次

信息摘要：

固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上冯乘，一條反應核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜晒夹、尼龍膜裆馒、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等丐怯。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標本用限制性內切酶消化后喷好，經瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經堿變性读跷，Tris緩沖液中和梗搅，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定后即可用于雜交效览。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著无切。

核酸分子雜交的類型

隨著基因工程研究技術的迅猛發(fā)展，新的核酸分子雜交類型和方法在不斷涌現(xiàn)和完善丐枉。核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型哆键。固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸游離在溶液中瘦锹。固體支持物有硝酸纖維素濾膜籍嘹、尼龍膜闪盔、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等辱士。液相雜交所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中泪掀。

由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去识补，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復性等優(yōu)點族淮，故該法為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交凭涂、斑點雜交祝辣、狹縫雜交、Southern印跡雜交切油、Northern印跡雜交蝙斜、組織原位雜交和夾心雜交等。

液相雜交是一種研究早且操作復合的雜交類型澎胡，在過去的30年里雖有時被應用孕荠，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高攻谁。近幾年由于雜交檢測技術的不斷改進稚伍，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應用，推動了液相雜交技術的迅速發(fā)展戚宦。下面對固相雜交和液相雜交分別進行介紹个曙。

（一）固相膜核酸分子雜交方法

固相核酸雜交多是在膜上進行，因此受楼，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法：

1．DNA的變性　

DNA變性解鏈是雜交成功的關鍵垦搬。Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h艳汽。DNA受酸猴贰、堿、熱等處理均能發(fā)生變性河狐，但強酸會使核酸降解米绕。一般認為堿變性較好，可避免DNA降解甚牲。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉义郑，pH7.0）下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使終濃度為0.1mol/L（pH約12.8）丈钙，室溫變性10min非驮，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調pH到7～8[亦可用堿變性后雏赦，調至中性劫笙，再加熱100芙扎。c 10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%）來檢測填大，變性DNA醇沉淀呈雪樣戒洼，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC允华，冰浴保存圈浇。

2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定　

硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h靴寂，涼干磷蜀。DNA樣品轉移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h百炬，然后在80度真空干燥2h或者在254nm紫外交聯(lián)儀用120mj能量固膜褐隆。

3．預雜交　

濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預熱至60剖踊。C的預雜交液（6×SSC庶弃，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）德澈。鮭魚精DNA需經過剪切和DNA酶消化處理歇攻，然后酒精沉淀純化，調濃度至10mg/ml梆造，用前放100掉伏。C水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷澳窑。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住供常。將雜交袋浸入68度水浴保溫3~12h摊聋。當預雜交液溫度升至68度時，在濾膜表面常會形成小氣泡栈暇。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡麻裁，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預雜交液很重要。

4．雜交　

從水浴中取出塑料袋源祈，用剪刀剪開一角煎源，盡可能擠凈預雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中香缺，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤（50μl/cm2）手销。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標記核酸探針图张，5×Denhardt液锋拖，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚精DNA诈悍。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴密封口兽埃，在分子雜交儀內進行雜交反應在68℃水浴中進行侥钳，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質及探針的比活性等情況而定，一般4～20h柄错。

5．洗膜　

取出塑料袋舷夺，用剪刀剪開，小心取出濾膜售貌，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中给猾，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中趁矾，室溫下洗滌15min（輕輕搖動）耙册。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動保溫2h毫捣，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min详拙。

洗膜的溫度一般應控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 + 0.41x(G +C) %）蔓同。雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數每增加1%而遞減1℃饶辙。

6．結果顯示　非放射性檢測方法前已述及，此處主要介紹放射性測定方法斑粱。固相膜的放射性雜交結果顯示有兩種方式弃揽，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計數法则北。前一種方法比較簡單矿微，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數小時至數天，再顯影尚揣、定影即可涌矢。對于雜交信號較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強曝光強度快骗。此外娜庇，為了減弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下進行方篮。液閃計數法主要用于打點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形名秀。方法是將完成雜交的膜在漂洗結束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶藕溅。加入2～5ml閃爍液匕得，剪2～3塊無樣品膜塊作為本底對照。在液體閃爍計數器上自動計數蜈垮。液體計數測定放射性強度也可在放射自顯影之后進行耗跛。

（二）固相核酸分子雜交類型

1．菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）　

菌落原位雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉移到硝酸纖維素濾膜上裕照，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交调塌，放射自顯影檢測菌落雜交信號晋南，并與平板上的菌落對位。

實驗步驟如下：

①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上羔砾，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上负间，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同姜凄。

②培養(yǎng)細菌至產生1～2mm大小的菌落政溃。

③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透态秧，倒掉多余液體董虱。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上申鱼，菌落面上在愤诱，注意防止在濾膜底面存有氣泡。

④5min后捐友，將濾膜轉至用變性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl）浸濕的濾紙上淫半，放置10min。

⑤將濾膜轉至中和溶液（1.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·HCl 匣砖，pH8.0）浸濕的濾紙上科吭，放置10min。重復中和1次猴鲫。

⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上对人，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)拂共。

⑦將濾膜用濾紙吸干规伐，80℃真空烘干2h。

以下操作參考前述匣缘。

2．斑點雜交（Dot blot）

斑點雜交法是將被檢標本點到膜上，烘烤固定或用紫外交聯(lián)儀輻照固定鲜棠。這種方法耗時短肌厨，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品豁陆。為使點樣準確方便柑爸，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如Minifold I和II盒音、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它們有許多孔表鳍，樣品加到孔中馅而，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔譬圣，取出膜烤干或254nm紫外交聯(lián)儀內紫外線照射以固定標本瓮恭，這時的膜就可以進行雜交。

（1）DAN斑點雜交

①先將膜在水中浸濕厘熟，再放到15×SSC中屯蹦。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min绳姨，冰中速冷登澜。

③用鉛筆在濾膜上標好位置，將DNA點樣于膜上飘庄。每個樣品一般點50μl（2～10μg DNA）脑蠕。

④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）RNA斑點雜交：

RNA斑點雜交與上法類似跪削，每個樣品至多加10μg總RNA（經酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化）谴仙。方法是將RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛）使RNA變性切揭。然后取5～8μl點樣于處理好的濾膜上狞甚，烘干。

培養(yǎng)細胞廓旬，標本處理技術可以簡化哼审，不用提取和純化RNA。方法是用含0.5%Nonidet P40的低滲緩沖液對多種動物細胞作簡單處理孕豹，離心去掉細胞核和細胞碎片涩盾，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細胞質提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性励背，不需加工直接點到硝酸纖維素膜上春霍。本法可以快速檢測大量標本，而只需極少量的細胞（5×104）或組織叶眉。

整個RNA實驗中址儒，要防止激活內源性RNase，有許多種預防措施衅疙，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復合物（RVC）莲趣。

（3）完整細胞斑點雜交：應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測饱溢。將整個細胞點到膜上喧伞，經NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定潘鲫，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測翁逞。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到少至5pg 的Epstein – Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本溉仑，因為它是使細胞直接在膜上溶解挖函，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交彼念。但它不適于非放射性標記探針挪圾，因為DNA純度不夠，會產生高本底逐沙。

3．Southern印跡雜交（southern blot ）　　

Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術哲思，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標本用限制性內切酶消化后吩案，經瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段棚赔，然后經堿變性，Tris緩沖液中和徘郭，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素濾膜上靠益，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著残揉。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交胧后，利用放射自顯影術確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小抱环。

（1）瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段（0.3～25kb）分離開壳快。分離大分子DNA片段（800～12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（500～1000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%）,300～5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠镇草，根據分離樣品量眶痰、分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽梯啤。

電泳時竖伯，同時將標記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量因宇。20伏恒壓電泳過夜七婴。電泳畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min察滑，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中本姥，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡杭棵，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5,曝光20～40s。

（2）硝酸纖維素濾膜吸印魂爪。

①將膠切成合適大小先舷，切去右上角作為記號。

②將膠放進盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH）的盤中輕搖動15min滓侍。

③換到中和緩沖液（1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl）中輕搖動30min蒋川。

④裁一張硝酸纖維素膜，2～4張3MM濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙）撩笆，都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大捺球，否則易形成旁路），先將硝酸纖維素膜浸到水中夕冲，再放入10×SSC中氮兵，接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴橡膠手套操作。

⑤平盤上放一塊比膠大的平板（盛膠槽翻過來即可）歹鱼，上面鋪一張3MM濾紙泣栈，起燈芯作用，盤中加少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚）弥姻，不能沒過平板南片，使3MM濾紙充分飽和。

⑥將膠倒扣到3MM濾紙上庭敦。

⑦浸濕的硝酸纖維素鋪在膠上疼进，對齊，鋪膜時從一邊逐漸放下秧廉，防止產生氣泡伞广，有氣泡時，可用吸管趕出定血，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸赔癌。

⑧膜上放一張3MM濾紙，不能與膠接觸澜沟。

⑨上面加吸印紙及重物（500g左右）灾票。

⑩通過濾紙的灶芯作用，平盤中的緩沖液就會通過膠上移茫虽，從而將DNA吸印到膜上刊苍，及時更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉印過夜濒析。

⑾去除上面的東西正什，用鑷了將膜取出，在6×SSC中洗一下（也可不洗）号杏。

⑿自然干燥婴氮，80℃烤2h斯棒。

⒀這時的膜就可進行雜交，或室溫密封保存主经。

Southern印跡雜交技術

Southern印跡雜交技術

4．Northern印跡雜交（Northern blot）　

這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法荣暮。DNA印跡技術由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術罩驻。RNA印跡技術正好與DNA相對應穗酥，故被趣稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為western blot惠遏。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似砾跃，只是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性节吮，而不用NaOH抽高，因為它會水解RNA的2’-羥基基團。RNA變性后有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合课锌，它同樣可在高鹽中進行轉印厨内，但在烘烤前與膜結合得并不牢固，所以在轉印后不能用低鹽緩沖液洗膜渺贤，否則RNA會被洗脫雏胃。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結合志鞍，為測定片段大小瞭亮，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下固棚，上色统翩、照像。樣品膠則進行Northern轉印此洲，標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L 醋酸銨中10min厂汗，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機拍照時呜师，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光娶桦，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低汁汗。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mR－NA時衷畦，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑知牌，但是有毒祈争，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。操作均應避免RNase的污染角寸。

下面介紹RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法：

（1）試劑

10×MSE緩沖液：0.2mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS）菩混，pH7.0, 50mmol/L 醋酸鈉忿墅，1mmol/l EDTA, pH8.0。

5×樣品緩沖液：50%甘油沮峡，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚藍球匕。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L）。應在通風柜中操作帖烘，pH高于4.0。

去離子甲酰胺橄杨。

50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)秘症。

0.1mol/L Tris·HCl,Ph7.5。

（2）步驟

①40ml水中加7g瓊脂糖式矫，煮沸溶解乡摹，冷卻到60℃，加7ml 10×MSE緩沖液采转、11.5ml甲醛聪廉，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽故慈。

②等膠凝固后板熊，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽察绷。

③使RNA變性（多20μg）：RNa 4.5μl干签，10×MSE緩沖液2.0μl，甲醛3.5μl拆撼，去離子甲酰胺10.0μl容劳。

④55℃加熱15min，冰浴冷卻闸度。

⑤加2μl 5×載樣緩沖液竭贩。

⑥上樣，同時加RNA標記物莺禁。

⑦60伏電泳過夜留量。

⑧取出凝膠，水中浸泡2次睁宰，每次5min肪获。

⑨室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA柒傻，以增強轉印孝赫。

⑩室溫下將膠浸到0.1mol/L Tris·HCl (Ph7.5)中45min，使膠中和红符。

⑾20×SSC洗膠1h青柄。

⑿20×SSC中過夜伐债，轉印到硝酸纖維素膜上。

⒀取出硝酸纖維膜致开，80℃真空烘烤2h峰锁。

5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）　

組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交双戳，它與菌落的原位雜交不同虹蒋。菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交飒货。而原位雜交是經適當處理后魄衅，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交塘辅。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內的空間位置晃虫，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如扣墩，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置哲银；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質內的功能排布；與細胞RNA的雜交可分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布呻惕。此外荆责，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。

用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA蟆融，也可以是RNA探針草巡。通常探針的長度以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低型酥。近研究結果表明山憨，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針弥喉。因此郁竟，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉錄標記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。

探針的標記物可以是放射性同位素由境，也可以是非放射性生物素和半抗原等棚亩。放射性同位素中，3H和35S為常用虏杰。3H標記的探針半衰期長讥蟆，成像分辨率高，便于定位纺阔，缺點是能量低瘸彤。35S標記探針活性較高，影像分辨率也較好笛钝。而32P能量過高质况，致使產生的影像模糊愕宋，不利于確定雜交位點。

原位雜交中结榄，標本的固定條件是影響雜交效率的重要因素中贝，標本組織蛋白質的消化程度對探針進入細胞極為重要。去除蛋白的方法是臼朗，用0.2mol/l HCl處理載玻片邻寿，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水视哑，原位雜交還是一種新技術老厌，發(fā)展很快，在敏感性黎炉、特異性和穩(wěn)定性上還需要進一步完善和提高（詳見二十章　）醋拧。

6．固相夾心雜交　　

Dunn等早介紹了夾心雜交類型慷嗜，Ranki等又作了進一步的改進。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：①樣品不需要固定丹壕，對粗制樣品能做出可靠的檢測庆械；②用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產生可檢測的信號菌赖。

固相夾心雜交需要兩個靠近而不互相重疊的探針缭乘，一個作固相吸附探針，另一個作標記檢測探針琉用。樣品基因組內核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結構堕绩。需注意的是兩個探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內，以避免產生高的本底信號（如一個克隆人Puc19,另一克隆人pBR322）邑时。

夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針奴紧，使用小珠可更好地進行標準化試驗和更容易對小量樣品進行操作。Dahlen 等利用微孔板進行夾心雜交晶丘，可同時進行大量樣品檢測黍氮，他們先吸取DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上浅浮。用微孔板進行夾心雜交還可直接用于PCR技術沫浆。應用光敏生物標記探針檢測PCR產物的敏感性和用32P標記探針（3×108cpm/μg）作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點還包括同時做多份樣品滚秩，加樣专执、漂洗和讀結果等步驟可以自動化。

7．其它雜交類型

（1）固化探針雜交：

該法較少使用叔遂，原理是使未標記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結合他炊，漂洗后争剿，用酶標抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結合。將乳膠顆粒收集痊末，吸附到膜上后漂洗蚕苇，加入底物顯色并進行測定。探針濃度2μg/ml,80℃雜交凿叠，可在10～15min完成涩笤，檢測的敏感性為5×108靶序列。

（2）反向雜交：這個雜交類型是用標記的樣品核酸與未標記的固化探針DNA雜交盒件，故稱為“反向雜交”蹬碧。這種雜交方法的優(yōu)點是在一次雜交反應中，可同時檢測樣品中幾種核酸炒刁。這種雜交方式主要用于進行中的核酸轉錄試驗和多種病原微生物的檢測恩沽。前者是在轉錄過程中標記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標記樣品核酸翔始。

（三）固相膜核酸雜交的幾點說明

1．雜交膜的選用　　

雜交膜是一種多孔罗心、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面城瞎，就可用雜交法進行檢測渤闷。常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射笥標記探針都很方便脖镀，產生的本底淺飒箭，與核酸結合的化學性質不是很清楚，推測為非共價鍵結合蜒灰。經80℃烤干2h或在紫外交聯(lián)儀輻照等雜交處理后弦蹂，核酸仍不會脫落。硝酸纖維素膜的另一特點是只與蛋白有微弱非特異結合强窖，這在使用非同位素探針中尤為有用盈匾。硝酸纖維素膜的缺點是結合核酸能力的大小取決于轉印條件和高濃度鹽（＞10×SSC），與小片段核酸（＜200bp）結合不牢毕骡，質地脆削饵，不易操作。

尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好未巫，它的強度大窿撬、耐用，可與小至10bp的片段共價結合叙凡。在低離子濃度緩沖液等多種條件下劈伴，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結合，且多數膜不需燒烤。尼龍膜韌性好跛璧，可反復處理與雜交严里，而不丟失被檢標本。它通過疏水鍵和離子鍵與核酸結合追城，結合力為350～500μg/cm2刹碾，比硝酸纖維素膜（80～100μg/cm2）強許多。尼龍膜的缺點是對蛋白有高親合力座柱，不宜使用非同位素探針迷帜。

2．“噪音”的排除　　

“噪音”（noise）是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標記DNA結合到空白膜上的放射性計數色洞，即本底戏锹。這個問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴格的雜交條件：二是選擇合適的雜交反應液和對膜進行處理。研究發(fā)現(xiàn)火诸，隨著離子強度的增加锦针，空白膜（未固定DNA對照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酚胺6×SSC的雜交反應液中充分封閉膜上的多余非特異結合位點置蜀。