紫外線交聯(lián)和免疫沉淀 （CLIP）

紫外線交聯(lián)和免疫沉淀 （CLIP）

原則

紫外線（UV）交聯(lián)是RNA生物化學(xué)家用來研究活組織中RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的經(jīng)典體外工具钙皮》淇疲科學(xué)家們已經(jīng)成功地使用CLIP（RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的交聯(lián)和免疫沉淀）來鑒定神經(jīng)元特異性RNA結(jié)合蛋白Nova家族的許多靶RNA顽决。隨著CLIP技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們正在試行將其與其他幾種感興趣的RNA結(jié)合蛋白一起使用导匣，特別是FMRP和Hu家族才菠。

圖1.CLIP的基本原理。暴露于紫外線時(shí)贡定，近端蛋白質(zhì)和RNA之間形成共價(jià)鍵赋访。這些鍵只發(fā)生在直接接觸的部位，并保留RNA-蛋白質(zhì)相互作用缓待。

紫外線（UV）暴露后蚓耽，相鄰蛋白質(zhì)和核酸之間形成共價(jià)鍵⌒矗基于這一特殊原理田晚，CLIP已被開發(fā)為使用UV測(cè)定RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物體內(nèi)交聯(lián)的常用方法。裂解交聯(lián)細(xì)胞后国葬，通過免疫沉淀（IP）分離靶蛋白贤徒。為了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物進(jìn)行測(cè)序，RNA接頭被轉(zhuǎn)移到3'末端汇四，放射性標(biāo)記的磷酸鹽被連接到5'末端接奈。使用凝膠電泳和膜轉(zhuǎn)移從游離RNA中分離RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后進(jìn)行蛋白酶K消化以從復(fù)合物中去除蛋白質(zhì)通孽。此步驟在交聯(lián)位點(diǎn)留下肽序宦，從而鑒定交聯(lián)核苷酸。將RNA接頭連接到5'末端后背苦，通過RT-PCR合成cDNA互捌。后一個(gè)cDNA核苷酸通過高通量測(cè)序鑒定。將讀段映射回轉(zhuǎn)錄組可以識(shí)別相互作用位點(diǎn)行剂。

程序

圖2.CLIP測(cè)定的工作流程秕噪。

1. 組織的紫外線交聯(lián)

從小鼠身上收獲大腦、脊髓或其他靶組織厚宰。將組織放在冰冷的HBSS中腌巾，直到收獲完成。設(shè)置一個(gè)500mL的Stericup铲觉，取下纖維素過濾器澈蝙，然后用200μm尼龍網(wǎng)片制作一個(gè)錐形過濾器以替換它。所得細(xì)胞懸液約為100mL撵幽，用于10個(gè)大腦灯荧。接下來，將組織懸液轉(zhuǎn)移到 50mL 管中盐杂，并在 4°C 下以 2500g 離心 5 分鐘逗载。 除去上清液并將組織重懸于原始組織體積的約10倍哆窿。將懸浮液放入150mm組織培養(yǎng)皿中，并將懸浮液放入紫外交聯(lián)儀照射400mJ / cm2撕贞。交聯(lián)時(shí)更耻，在組織懸浮液下方使用一盤冰塊以保持懸浮液低溫测垛。

將輻照的懸浮液收集在50mL管中捏膨，然后用額外的5mL HBSS洗滌每個(gè)板，也收集這種洗滌食侮。在4°C下以2500rpm再次旋轉(zhuǎn)組織5分鐘号涯。 將組織重懸于原始組織體積的2倍，并將溶液移液到管中锯七。短暫旋轉(zhuǎn)試管并取出上清液链快。在-80°C下冷凍直至使用。

2. 珠子制備

移液 100μL 蛋白 A Dynabead 珠溶液眉尸。將磁珠放入磁性支架中域蜗，用 500μL 1X PXL 捕獲和清洗磁珠。再重復(fù)洗滌兩次噪猾。將磁珠重懸于 100μL 的 1X PXL 中霉祸，并加入適量的抗 RNA 結(jié)合蛋白抗體。在室溫下?lián)u動(dòng)試管30分鐘至45分鐘袱蜡，使抗體與磁珠結(jié)合丝蹭。用 1X PXL 清洗珠子三次。

3. 交聯(lián)裂解液檢查

使用 100μL 冰冷的 1X PXL 裂解每 100μL 交聯(lián)細(xì)胞坪蚁。將裂解物放在冰上10分鐘奔穿。向每個(gè)試管中加入 10μL RNasin 和 10μL RQ1 脫氧核糖核酸酶;在 37°C 下孵育 15 分鐘。向溶液中加入 1μL RNase T1 儲(chǔ)備液 （1 U/μL）;在37°C孵育10分鐘敏晤，以1000rpm振蕩贱田。接下來，在預(yù)冷的微量超速離心機(jī)中以 90K 在 4°C 下旋轉(zhuǎn)裂解物 25 分鐘嘴脾。

4. 免疫沉淀

對(duì)于免疫沉淀湘换，小心地從沉淀碎片中除去上清液，并將上清液添加到一管制備的珠子中统阿。每 300μL 交聯(lián)組織使用約 100μL 磁珠彩倚。在 4°C 下?lián)u動(dòng)珠子/裂解物 1 小時(shí)。 用 1mL 冰冷的 1X PXL 清洗 3 次扶平，用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗兩次帆离。

5. 激酶免疫沉淀的RNA

將磁珠重懸于80μL 1X PNK+中，加入5μL P32 γ-ATP（γ-腺苷三磷酸）（>3000Ci/mM）和2μL PNK酶结澄。在37°C的熱混合器中孵育哥谷，并以1000rpm離心20分鐘岸夯。通過加入5μL 1mM ATP完成反應(yīng)。讓反應(yīng)在 37°C 下再繼續(xù) 5 分鐘们妥。 用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗珠子四次猜扮。將磁珠重懸于30μL 1X PNK+和30μL Novex LDS上樣緩沖液中。

6. SDS-PAGE凝膠和轉(zhuǎn)印

加載 2 孔/管的 Novex NuPAGE 10% 雙三凝膠监婶。在150V下運(yùn)行凝膠旅赢，直到染料前沿位于凝膠底部。凝膠電泳后惑惶，使用Novex濕轉(zhuǎn)印裝置將凝膠轉(zhuǎn)移到一塊S&S BA-85硝酸纖維素上煮盼。轉(zhuǎn)移后，用1X PBS沖洗NC過濾器带污，并在餐巾紙上輕輕吸干僵控。用保鮮膜包裹膜并暴露在薄膜下。

7. 切出交聯(lián)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物

一般來說鱼冀，RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物以大約蛋白質(zhì)和RNA的總分子量運(yùn)行报破。使用手術(shù)刀刀片切掉這條帶子，然后將硝酸纖維素切成小塊千绪。將這些碎片放入一個(gè)干凈的管子中充易。

8. RNA分離純化

在1X PK緩沖液中制備4mg / mL蛋白酶K溶液;將該儲(chǔ)備液在 37°C 下預(yù)孵育 20 分鐘以消化任何 RNase。向每管分離的NC片中加入200μL該蛋白酶K溶液;在37°C振蕩（1200rpm）孵育20分鐘翘紊。加入 200μL PK/7 M 尿素緩沖液;在37°C振蕩（1200rpm）下再孵育20分鐘蔽氨。

加入 400μL RNA 苯酚和 130μL CHCl3 溶液。渦旋這些管帆疟，然后在37°C下以1400rpm振蕩（1200rpm）孵育20分鐘鹉究。接下來，在4°C或室溫的微量離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)管10分鐘踪宠。將每個(gè)試管的水相放入干凈的試管中自赔，加入 50μL 3M NaOAc、pH 5.2 和 1mL 的 1：1 乙醇和異丙醇混合物柳琢。在 ?20°C 下沉淀過夜绍妨。

9. 核糖核酸連接

在冷離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)RNA30分鐘。用 100μL 75% 乙醇洗滌沉淀柬脸，然后在 SpeedVac 中干燥沉淀他去。通過切倫科夫計(jì)數(shù)在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)RNA。使用 T4 RNA 連接酶進(jìn)行 RNA 連接倒堕。

10. 連接RNA的純化

如上所述旋轉(zhuǎn)灾测、洗滌和干燥 RNA 沉淀。通過閃爍計(jì)數(shù)器中的Cerenkov計(jì)數(shù)檢查RNA回收率垦巴。倒入20%變性聚丙烯酰胺凝膠（1：19雙：丙烯酰胺媳搪，7M尿素）铭段。將整個(gè)連接反應(yīng)重懸于5μL H 2 O和5μL甲酰胺上樣緩沖液中。將重懸的RNA在95°C下加熱5分鐘秦爆，然后將整個(gè)溶液上樣到凝膠上;使用放射性標(biāo)記的PhiX標(biāo)記物來調(diào)整RNA的大小序愚。

凝膠電泳后，將凝膠放在一塊舊薄膜上等限，并用保鮮膜包裹爸吮。將薄膜放在-80°C下，通常過夜以獲得良好的信號(hào)精刷。使用曝光的薄膜拗胜，切出大于約65nt的RNA蔗候。將凝膠切片放入試管中;加入350μL核酸洗脫緩沖液怒允，用1mL注射器柱塞壓碎;在熱混合器中以 37°C 以 1200rpm 孵育 30 分鐘。用切斷的P1000锈遥，將凝膠漿液轉(zhuǎn)移到已添加1cm玻璃預(yù)過濾器的色譜柱中纫事。在微量離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)色譜柱，取出流通物并將其放入干凈的管中所灸。加入 1mL 1：1 乙醇和異丙醇混合物以及 2μL 糖原（20mg/mL 原液）丽惶，并在 ?20°C 下沉淀過夜。

11. cDNA 和 PCR

如上所述旋轉(zhuǎn)爬立、洗滌和干燥 RNA;在閃爍計(jì)數(shù)器中再次計(jì)數(shù)RNA以定量產(chǎn)量钾唬。將純化的RNA重懸于9μL H 2 O中，并以5pmol/μL加入2μL DP3侠驯。在65°C加熱5分鐘;放松和快速旋轉(zhuǎn)抡秆。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增吟策。

倒入10%變性聚丙烯酰胺凝膠儒士，并在凝膠上運(yùn)行約10μL的PCR反應(yīng);使用放射性標(biāo)記的標(biāo)記物和放射自顯影凝膠。剪掉大約 60-100nt 的主要波段（如果有的話檩坚，還可以切掉 100nt 及以上）着撩。像上面對(duì)RNA所做的那樣純化和沉淀DNA，但讓DNA從粉碎的凝膠漿液中洗脫至少4小時(shí)匾委。沉淀后拖叙，將純化的DNA重懸于5–10μL水中。

12. TOPO克隆和測(cè)序

我們又使用了三到四輪PCR（如果您的次PCR產(chǎn)量較低赂乐，則可以使用更多）薯鳍。使用離心柱對(duì)反應(yīng)進(jìn)行脫鹽。然后沪猴，生成 3' A 端辐啄。在72°C孵育20分鐘;放在冰上采章，立即用于TOPO克隆反應(yīng)。輕輕混合并在室溫下孵育 5 分鐘（儲(chǔ)存 3μL壶辜，在 ?20°C 下進(jìn)行天克隆時(shí)不使用悯舟，以進(jìn)行潛在的后續(xù)轉(zhuǎn)化）。按照 TOPO 克隆試劑盒的建議轉(zhuǎn)化大腸桿菌砸民。像其他測(cè)序反應(yīng)一樣對(duì)單個(gè)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行小型制備和測(cè)序抵怎。

13. 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

如果不能識(shí)別CLIP標(biāo)簽的親本RNA，那么CLIP實(shí)驗(yàn)就毫無用處岭参。美國(guó)生物技術(shù)信息中心 （NCBI） 現(xiàn)在有一個(gè)專門的 BLAST 搜索頁(yè)面反惕，供那些尋找簡(jiǎn)短、幾乎完全匹配的人使用演侯，它非常適合 CLIP 標(biāo)簽識(shí)別姿染。

本文由谷歌翻譯軟件自動(dòng)翻譯，原文請(qǐng)瀏覽www.creativebiomart.net/resource/principle-protocol-crosslinking-and-immunoprecipitation-clip-388.htm