電洗脫法基本原理和實驗方法

電洗脫法基本原理

將電泳分離后含目的DNA片段的瓊脂糖切割下來辱姨， 裝于透析袋中柿菩，繼續(xù)在高電壓下電泳，這時目的DNA會從凝膠中電泳出進入透析袋中雨涛， 由于DNA分子量大枢舶，不能透過透析袋，從而保留于透析袋中替久。取出透析袋中含DNA的溶液凉泄， 進一步用酚、氯仿抽提純化蚯根。

電洗脫法實驗方法

（一）透析袋的處理：

1．切取適當長度適析袋后众。

2．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分鐘。

3．棄去煮沸液，加無菌水內(nèi)外反復洗凈透析袋蒂誉。

（二）電洗脫

1．在長波紫外燈下（300－360nm ）將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中教藻。

2．向透析袋內(nèi)加入２ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠右锨，并排空汽泡括堤。

3．將透析袋水平放入電泳槽（長度方向與電泳平行）， 加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約６－７mm）绍移。

4．接通電源痊臭，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠登夫。

5．改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘广匙。

6．從透析袋中吸出緩沖液于1－5ml Eppendorf管中。

7．加入1.5倍體積正丁醇恼策，混勻抽提去EB鸦致。

8．在臺式離心機上高速2分鐘。

9．吸去上層涣楷，正丁醇溶液分唾。

10．重復7，8狮斗，9二次绽乔。

11．自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿（２個）抽提２次。

12．上清轉入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc ２倍體積預冷無水乙醇碳褒，于20℃過夜折砸。

13．12000g，4℃下離心10分鐘沙峻，得DNA沉淀睦授。

14．棄上清，加入70％乙醇洗滌２次后棄干乙醇摔寨。

15．加入50μl TE溶解DNA去枷。

16．取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8％瓊脂糖上， 40伏電泳是复，3小時删顶。

17．在紫外透射儀上觀察結果。

18．測定DNA溶液OD260,OD280值淑廊。

結果與分析

1．計算DNA回收效率逗余，判斷DNA純度。

2．記錄電泳結果

從瓊脂糖凝膠（Agaros gel）中回收DNA片段實驗步驟

1. 配制TAE電泳緩沖液(10′儲存液)蒋纬，10′加樣緩沖液猎荠，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌)蜀备。

2. 操作步驟

1) 用1′TAE配制1%瓊脂糖凝膠关摇。DNA用合適的酶切。

2) 在膠上選定兩個加樣孔碾阁，分別加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切產(chǎn)物输虱，電泳。

3) 電泳結束后用刀片切下含有少量DNA酶切產(chǎn)物的泳道(一般選擇位于凝膠的邊緣)脂凶，在紫外燈下找到目的DNA 帶宪睹，用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個小口作為標記。注意：含有大量DNA酶切產(chǎn)物的凝膠既不用加熒光染料蚕钦，也不用紫外燈照射亭病！

4) 將做好標記的凝膠條與未染色的凝膠原位對齊，根據(jù)小膠條上的標記估計未染色的大膠上DNA酶切產(chǎn)物的位置嘶居，用刀片切下大膠中DNA產(chǎn)物所在的凝膠(盡量不要多余的凝膠)罪帖，轉移至一個稱量過的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計算出膠的重量邮屁。

5) 按照DNA快速純化/回收試劑盒操作說明整袁，純化回收目的片段。